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使用土壤硝酸還原酶測(cè)試盒測(cè)定的意義及操作方法

更新時(shí)間:2022-09-26  |  點(diǎn)擊率:1444
  S-NR催化土壤中硝酸鹽還原為亞硝酸鹽,是土壤硝態(tài)氮還原的關(guān)鍵酶。研究S-NR的活性對(duì)合理施肥,降低氮素的損失具有重要意義。
 
  測(cè)定原理
 
  S-NR催化硝酸鹽還原為亞硝酸鹽,NO3ˉ+NADH+H+→NO2ˉ+NAD++H2O;產(chǎn)生的亞硝酸鹽能夠在酸性條件下,與對(duì)–氨基苯磺酸及α-萘胺定量生成紅色偶氮化合物;生成的紅色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰,可用分光光度法測(cè)定。
 
  土壤硝酸還原酶測(cè)試盒的操作步驟:
 
  實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前,各試劑均應(yīng)平衡至室溫(試劑不能直接在37℃溶解);試劑或樣品稀釋時(shí),均需混勻,混勻時(shí)盡量避免起泡。實(shí)驗(yàn)前應(yīng)預(yù)測(cè)樣品含量,如樣品濃度過(guò)高時(shí),應(yīng)對(duì)樣品進(jìn)行稀釋,以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測(cè)范圍,計(jì)算時(shí)再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
 
  1.加樣:分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100μl,余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100μl,注意不要有氣泡,加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動(dòng)混勻,酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,37℃反應(yīng)120分鐘。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性,每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
 
  2.棄去液體,甩干,不用洗滌。每孔加檢測(cè)溶液A工作液100μl(在使用前一小時(shí)內(nèi)配制),酶標(biāo)板加上覆膜,37℃反應(yīng)60分鐘。
 
  3.溫育60分鐘后,棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板3次,每次浸泡1-2分鐘,大約400μl/每孔,甩干(也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干)。
 
  4.每孔加檢測(cè)溶液B工作液(同檢測(cè)A工作液)100μl,酶標(biāo)板加上覆膜37℃反應(yīng)60分鐘。
 
  5.溫育60分鐘后,棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板5次,每次浸泡1-2分鐘,350μl/每孔,甩干(也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干)。
 
  6.依序每孔加底物溶液90μl,酶標(biāo)板加上覆膜37℃避光顯色(30分鐘內(nèi),此時(shí)肉眼可見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色,后3-4孔梯度不明顯,即可終止)。
 
  7.依序每孔加終止溶液50μl,終止反應(yīng),此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液。

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